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熒光觀察用什么物鏡?
來源:技術文章    發布時間:2022-12-02    瀏覽:320次

熒光觀察用什么物鏡?熒光顯微鏡用什么物鏡

熒光觀察是現代科研、生命科學和醫學檢查中都廣泛應用的一種觀察方式,那么熒光觀察用什么物鏡呢?有些老師可能就說要用“熒光物鏡",但“熒光物鏡"到底是什么意思?跟普通物鏡又有什么區別?如果您搞不明白,今天這篇文章可以為您解惑。


·“熒光物鏡"是什么?


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熒光物鏡


熒光物鏡,從字面上來看,就是適合熒光觀察的物鏡,雖然它的確適合熒光觀察,但這并不是它名字來由。


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螢石鏡片


熒光物鏡(Fluor)現在的標準稱呼其實是“半復消色差物鏡"(Semi-Apo)或者“平場半復消色差物鏡",因為這種物鏡生產時使用到了螢石(Fluorite)鏡片,故稱“螢石物鏡"、“熒光物鏡"。實際在無限遠光學時代,半復消色差物鏡已經可以不用螢石鏡片也能做出來。


相比普通物鏡,熒光物鏡不僅在熒光觀察中有更好的表現,在明場、暗場等觀察中,它也因為有更高的數值孔徑、更強的消色差表現,能提供更明亮、更高對比度的清晰成像。


·基礎知識:消色差是什么?

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普通平場消色差物鏡


消色差物鏡(Ach)/平場消色差物鏡(Plan Ach),都是主流,這些就是普通物鏡。熒光物鏡是半復消色差物鏡/平場半復消色差物鏡,與普通物鏡區別在于消色差水平。


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白光通過三棱鏡折射出七色光譜


要理解兩者區別,首先得搞明白什么是色差(Chromatic Aberration)。陽光可以形成“赤橙黃綠青藍紫"七色彩虹,因為它的光譜包含這些顏色。


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軸向色差


在通過透鏡時,光譜中不同顏色的光會在不同的焦面聚焦,藍色在距離透鏡近的距離聚焦,綠色還得遠一點,紅色離得更遠,這意味著紅綠藍三色無法在同個焦面聚焦,成像會偏色,同時高對比的邊緣會有不聚焦的其他顏色,通常呈現為紫邊、暈環,影響對比度和清晰度,這就是軸向色差(Axial Chromatic Aberration).


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橫向色差(光路圖虛線部分)


另一種色差,是同一顏色的光通過鏡片中間和鏡片邊緣時,會在聚焦面形成不一致的放大效果,如中間是1.0倍,邊緣可能就是1.3倍,這個倍率差異每個顏色都有,而且每個顏色的差異不一致,其結果就是在成像外圍一圈的成像出現彩色的邊緣,這就是放大率色差,或者叫橫向色差(Lateral Chromatic Aberration).


軸向色差在成像Z軸,橫向色差在成像XY軸,前者只能在物鏡層面校正,后者的校正方法比較復雜,固定筒長和無限遠光學有不同策略,不同品牌之間也有差異,我們先略過,后面再說。


·熒光物鏡和普通物鏡區別何在?

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消色差鏡組


18世紀,光學家John Dollond發明了消色差鏡組,將紅藍兩色聚焦到跟綠色焦面相近的焦面,從而大大減少了軸向色差,提升了清晰度,而且他的設計成本夠低,因此消色差物鏡自此逐漸成為了望遠鏡和顯微鏡的基本配置,直至今天。普通消色差設計,可以校正紅藍兩色色差,以及綠色波段的球差。


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熒光物鏡規格對比


熒光物鏡,或者說半復消色差物鏡,通過引入螢石鏡片等先進材料和更復雜鏡組,進一步強化了軸向色差校正能力,可以將紅綠藍三色甚至四色聚焦到同一個焦面,并校正紅綠藍三色甚至四色的球差。


熒光物鏡工作距離較普通消色差更短,擁有顯著更高的數值孔徑(N.A),成像更清晰、銳利、高襯度,另外熒光物鏡成像像場普遍達到26.5mm,適合搭配25mm超寬視場目鏡,比普通消色差18-23mm的視場大一圈,在各種鏡檢觀察中,你都能明顯體驗到半復消色差相對普通消色差帶來的巨大提升。


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高分辨率成像通常用APO物鏡


如果加入更多鏡組,將色差校正提升到四色或者五色水平,就得到復消色差物鏡(APO)了,它工作距離更短,數值孔徑更高,幾乎把整個光譜的色差都給消除了,適合各種高分辨率成像,但對于大部分鏡檢來說,從半復消色差到復消色差的提升并沒有那么巨大,因此鏡檢應用中并不普及。


需要補充的是,熒光物鏡也是有效果差異的,有些熒光物鏡的色差校正和球差校正都更強,有些則只是強化了球差校正,另外即便同樣是熒光物鏡,不同鍍膜技術的差異,也會讓熒光物鏡在透過率方面出現差距,明美高透過率的熒光物鏡在熒光觀察和暗場觀察、正交偏光等觀察中更有優勢。


·能隨便買個熒光物鏡給自己的顯微鏡升級嗎?

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平場消色差物鏡常用于醫院熒光鏡檢


使用熒光物鏡做熒光觀察,不僅目視成像背景更暗、熒光更明亮清晰,相機CCD成像的效果也會清晰銳利。那么對于已有平場消色差物鏡的用戶來說,能不能隨便買個熒光物鏡給自己的顯微鏡升級呢?


答案是否定的。這就需要補充剛剛提到但還沒講完的問題,橫向色差的消除。


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補償目鏡


在固定筒長的舊時代,物鏡的橫向色差問題很難解決,廠商的策略是以毒攻毒,用同樣有橫向色差,但差異率反過來的目鏡進行補償,從而實現成像的消色差。如果不使用補償目鏡,成像畫面的外圍將會非常糟糕。


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明美物鏡采用獨立消色差設計


到固定筒長末期和無限遠光學時代,奧林巴斯和尼康終于實現在物鏡層面把橫向色差解決掉,稱為“獨立色差校正",而蔡司和萊卡則沿用固定筒長時代的策略,將補償橫向色差的任務交給了觀察頭底部的管透鏡和目鏡鏡,需使用跟物鏡配套的觀察頭才能消色差。明美物鏡采用的是獨立消色差設計,更便于實現高質量的顯微相機成像和定制產品開發。


無限遠光學時代不同系統之間還有齊焦距離、齊軸性和基準焦距等差異,不建議用戶自行購買熒光物鏡進行升級,以免出現兼容問題導致效果不佳或使用體驗不好,升級物鏡請聯系原廠或明美等業的顯微鏡廠家。另外明美還提供LED數顯熒光模塊,適合把無限遠光學的普通顯微鏡升級成熒光顯微鏡,包括奧林巴斯CX23正置、尼康TS100倒置、蔡司V8體視等都可以。


總結:普通消色差物鏡可以校正紅藍色差和綠球差,足夠滿足醫院真菌檢查等常規熒光鏡檢;熒光物鏡(半復消色差物鏡)可以校正紅綠藍三色的色差和球差,熒光信號更強,信噪比更高,適合FISH熒光原位雜交等高要求的熒光成像。同時在偏光、暗場等其他觀察方式下,熒光物鏡也會有更好的表現,前提是升級的物鏡跟機身、觀察頭有良好的適配,建議找原廠或專業顯微鏡廠家升級。



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